# Overlap extension PCR Cloning을 하다보면, template이 없는 상황에서 긴 DNA fragment를 만들어야 할 경우가 있다. 만약 짧은 fragment의 경우에는 긴 primer 쌍을 주문해서 서로 PCR을 해서 얻어낼 수 있다. 하지만, 원하는 DNA sequence가 수 백 bp 수준으로 길어서 primer로 주문할 수 없는 경우가 있다. 아예 수 천 bp 수준으로 길면 gBlock 등으로 long fragment 합성 주문을 하고 기다리겠지만, 이는 비용도 비싸고 시간도 수 십일 이상으로 오래 걸린다. 만약 fragment가 수 백 bp 수준으로 비교적 짧은 경우에는, overlap extension PCR로 원하는 DNA fragment를 얻을 수 있다. ## Overlap extension PCR

Overlap extension PCR의 예시

Overlap extension PCR은 위와 같이 primer들을 길게 주문해서 증폭되는 fragment끼리 overlap이 생기도록 만들어준 후, 다시 그 fragment들을 함께 넣고 PCR을 해서 서로가 달라붙어서 증폭되도록 해주는 방법이다. Primer 혹은 fragment 사이의 overlap은 Tm이 63℃ 이상이 되도록 디자인 해준다. 경우에 따라서는 2쌍 (총 4개 primer)를 한번의 reaction tube에 넣고 fragment를 한번에 만들어낼 수도 있으나, 잘 안 되는 경우도 종종 있으니 각 fragment를 따로 만들어주면서 단계별로 증폭해가는 것을 추천한다. 더 길이가 긴 fragment를 합성해야 할 때에는 primer 쌍을 연결될 수 있도록 계속 더 주문하고, PCR 개수를 늘리면 된다. 하지만 수 천 bp 이상부터는 long fragment 합성 주문을 추천한다. PCR 과정을 늘릴 수록 mutation이 생길 가능성이 높기 때문이다. ## 예시: 443bp fragment 합성 ShS15라는 DNA fragment를 합성하기 위해 사용했던 primer의 예시이다.

합성하려는 DNA fragment와 사용할 primers

### PCR step 1 이하 모든 PCR은 Q5® High-Fidelity DNA Polymerase ([NEB, M0491L](https://international.neb.com/products/m0491-q5-high-fidelity-dna-polymerase#Product%20Information))을 사용했다. | Reagent | Volumn | | ----------------------- | ------------------- | | Q5 polymerase | 0.5 uL | | Q5 reaction buffer (5X) | 10uL | | FP (100pmol) | 1uL | | RP (100pmol) | 1uL | | dNTP | 1uL | | D.W. | 36.5uL (up to 50uL) | 각 fragment를 증폭하기 위한 첫 PCR이다. 아래의 조합들로 primer를 넣어 PCR 했다. | Target fragment | FP | RP | | --------------- | --------- | --------- | | Step1-Frag1 | ShS15\_F1 | ShS15\_R1 | | Step1-Frag2 | ShS15\_F2 | ShS15\_R2 | | Step1-Frag3 | ShS15\_F3 | ShS15\_R3 | PCR: 98℃ (2min) - \[98℃ (25s) - 59℃ (25s) - 72℃ (30s)] x 30 cycles - 72℃ (3min) - 16℃ ### PCR step 2 | Reagent | Volumn | | ----------------------- | ----------------- | | Q5 polymerase | 0.5 uL | | Q5 reaction buffer (5X) | 10uL | | FP (10pmol) | 2.5uL | | RP (10pmol) | 2.5uL | | Fragment A PCR product | 5uL | | Fragment B PCR product | 5uL | | dNTP | 1uL | | D.W. | 23.5 (up to 50uL) | {% hint style="info" %} Fragment A/B PCR product는 purification 과정 없이 그대로 사용한 것. {% endhint %} 아래의 조합의 primer와 fragment를 사용했다. Step2-Fragment 2의 경우에는 3' end 쪽으로 추가 연장만 필요했기 때문에 fragment B가 없다.
Target fragmentFPRPFrag AFrag B
Step2-Frag1ShS15_F1ShS15_R2Step1-Frag1Step1-Frag2
Step2-Frag2ShS15_F3ShS15_R4Step1-Frag3X (D.W. added)
PCR: 98℃ (2min) - \[98℃ (25s) - 59℃ (25s) - 72℃ (30s)] x 30 cycles - 72℃ (3min) - 16℃ ### PCR step 3 | Reagent | Volumn | | ----------------------- | ------------------- | | Q5 polymerase | 0.5uL | | Q5 reaction buffer (5X) | 10uL | | ShS15\_F1 (10pmol) | 2.5uL | | ShS15\_R4 (10pmol) | 2.5uL | | Step2-Frag1 | 3uL | | Step2-Frag2 | 3uL | | dNTP | 1uL | | D.W. | 27.5uL (up to 50uL) | PCR: 98℃ (2min) - \[98℃ (25s) - 59℃ (25s) - 72℃ (30s)] x 25 cycles - 72℃ (3min) - 16℃ 최종 product (step3 PCR)를 2% agarose gel에 내려봤을 때, 예상하는 사이즈에서 밴드가 나오는 것을 볼 수 있다. 이를 [gel purification](/protocol/biology/basic-experiments/basic-methods/gel-purification.md)한 후, cloning 등 원하는 목적에 사용한다. {% hint style="warning" %} PCR을 통해 얻은 것이므로, 반드시 sequencing해서 mutation 여부를 확인해야 한다. {% endhint %}

Overlap extension PCR product를 gel에 내려서 찍은 결과 사진. Step2 Frag 1/2는 총 30 cycles을 돌린 후 step 3에 일부 넣은 후 추가로 30 cycles PCR을 돌린 것을 내린 것이다 (총 60 cycles).

{% hint style="info" %} 위 예시에서는 밴드가 강하게 나왔으므로, 양이 충분하다면 PCR cycle 수를 낮춰도 좋다. {% endhint %} --- # Agent Instructions: Querying This Documentation If you need additional information that is not directly available in this page, you can query the documentation dynamically by asking a question. Perform an HTTP GET request on the current page URL with the `ask` query parameter: ``` GET https://gsyu.gitbook.io/protocol/biology/basic-experiments/basic-methods/overlap-extension-pcr.md?ask= ``` The question should be specific, self-contained, and written in natural language. The response will contain a direct answer to the question and relevant excerpts and sources from the documentation. Use this mechanism when the answer is not explicitly present in the current page, you need clarification or additional context, or you want to retrieve related documentation sections.