Cloning을 하다보면, template이 없는 상황에서 긴 DNA fragment를 만들어야 할 경우가 있다. 만약 짧은 fragment의 경우에는 긴 primer 쌍을 주문해서 서로 PCR을 해서 얻어낼 수 있다.
하지만, 원하는 DNA sequence가 수 백 bp 수준으로 길어서 primer로 주문할 수 없는 경우가 있다. 아예 수 천 bp 수준으로 길면 gBlock 등으로 long fragment 합성 주문을 하고 기다리겠지만, 이는 비용도 비싸고 시간도 수 십일 이상으로 오래 걸린다.
만약 fragment가 수 백 bp 수준으로 비교적 짧은 경우에는, overlap extension PCR로 원하는 DNA fragment를 얻을 수 있다.
Overlap extension PCR
Overlap extension PCR의 예시
Overlap extension PCR은 위와 같이 primer들을 길게 주문해서 증폭되는 fragment끼리 overlap이 생기도록 만들어준 후, 다시 그 fragment들을 함께 넣고 PCR을 해서 서로가 달라붙어서 증폭되도록 해주는 방법이다. Primer 혹은 fragment 사이의 overlap은 Tm이 63℃ 이상이 되도록 디자인 해준다.
경우에 따라서는 2쌍 (총 4개 primer)를 한번의 reaction tube에 넣고 fragment를 한번에 만들어낼 수도 있으나, 잘 안 되는 경우도 종종 있으니 각 fragment를 따로 만들어주면서 단계별로 증폭해가는 것을 추천한다.
더 길이가 긴 fragment를 합성해야 할 때에는 primer 쌍을 연결될 수 있도록 계속 더 주문하고, PCR 개수를 늘리면 된다. 하지만 수 천 bp 이상부터는 long fragment 합성 주문을 추천한다. PCR 과정을 늘릴 수록 mutation이 생길 가능성이 높기 때문이다.
예시: 443bp fragment 합성
ShS15라는 DNA fragment를 합성하기 위해 사용했던 primer의 예시이다.
합성하려는 DNA fragment와 사용할 primers
PCR step 1
이하 모든 PCR은 Q5® High-Fidelity DNA Polymerase (NEB, M0491L)을 사용했다.
Reagent
Volumn
Q5 polymerase
0.5 uL
Q5 reaction buffer (5X)
10uL
FP (100pmol)
1uL
RP (100pmol)
1uL
dNTP
1uL
D.W.
36.5uL (up to 50uL)
각 fragment를 증폭하기 위한 첫 PCR이다. 아래의 조합들로 primer를 넣어 PCR 했다.
