# Overlap extension PCR Cloning을 하다보면, template이 없는 상황에서 긴 DNA fragment를 만들어야 할 경우가 있다. 만약 짧은 fragment의 경우에는 긴 primer 쌍을 주문해서 서로 PCR을 해서 얻어낼 수 있다. 하지만, 원하는 DNA sequence가 수 백 bp 수준으로 길어서 primer로 주문할 수 없는 경우가 있다. 아예 수 천 bp 수준으로 길면 gBlock 등으로 long fragment 합성 주문을 하고 기다리겠지만, 이는 비용도 비싸고 시간도 수 십일 이상으로 오래 걸린다. 만약 fragment가 수 백 bp 수준으로 비교적 짧은 경우에는, overlap extension PCR로 원하는 DNA fragment를 얻을 수 있다. ## Overlap extension PCR

Overlap extension PCR의 예시

Overlap extension PCR은 위와 같이 primer들을 길게 주문해서 증폭되는 fragment끼리 overlap이 생기도록 만들어준 후, 다시 그 fragment들을 함께 넣고 PCR을 해서 서로가 달라붙어서 증폭되도록 해주는 방법이다. Primer 혹은 fragment 사이의 overlap은 Tm이 63℃ 이상이 되도록 디자인 해준다. 경우에 따라서는 2쌍 (총 4개 primer)를 한번의 reaction tube에 넣고 fragment를 한번에 만들어낼 수도 있으나, 잘 안 되는 경우도 종종 있으니 각 fragment를 따로 만들어주면서 단계별로 증폭해가는 것을 추천한다. 더 길이가 긴 fragment를 합성해야 할 때에는 primer 쌍을 연결될 수 있도록 계속 더 주문하고, PCR 개수를 늘리면 된다. 하지만 수 천 bp 이상부터는 long fragment 합성 주문을 추천한다. PCR 과정을 늘릴 수록 mutation이 생길 가능성이 높기 때문이다. ## 예시: 443bp fragment 합성 ShS15라는 DNA fragment를 합성하기 위해 사용했던 primer의 예시이다.

합성하려는 DNA fragment와 사용할 primers

### PCR step 1 이하 모든 PCR은 Q5® High-Fidelity DNA Polymerase ([NEB, M0491L](https://international.neb.com/products/m0491-q5-high-fidelity-dna-polymerase#Product%20Information))을 사용했다. | Reagent | Volumn | | ----------------------- | ------------------- | | Q5 polymerase | 0.5 uL | | Q5 reaction buffer (5X) | 10uL | | FP (100pmol) | 1uL | | RP (100pmol) | 1uL | | dNTP | 1uL | | D.W. | 36.5uL (up to 50uL) | 각 fragment를 증폭하기 위한 첫 PCR이다. 아래의 조합들로 primer를 넣어 PCR 했다. | Target fragment | FP | RP | | --------------- | --------- | --------- | | Step1-Frag1 | ShS15\_F1 | ShS15\_R1 | | Step1-Frag2 | ShS15\_F2 | ShS15\_R2 | | Step1-Frag3 | ShS15\_F3 | ShS15\_R3 | PCR: 98℃ (2min) - \[98℃ (25s) - 59℃ (25s) - 72℃ (30s)] x 30 cycles - 72℃ (3min) - 16℃ ### PCR step 2 | Reagent | Volumn | | ----------------------- | ----------------- | | Q5 polymerase | 0.5 uL | | Q5 reaction buffer (5X) | 10uL | | FP (10pmol) | 2.5uL | | RP (10pmol) | 2.5uL | | Fragment A PCR product | 5uL | | Fragment B PCR product | 5uL | | dNTP | 1uL | | D.W. | 23.5 (up to 50uL) | {% hint style="info" %} Fragment A/B PCR product는 purification 과정 없이 그대로 사용한 것. {% endhint %} 아래의 조합의 primer와 fragment를 사용했다. Step2-Fragment 2의 경우에는 3' end 쪽으로 추가 연장만 필요했기 때문에 fragment B가 없다.
Target fragmentFPRPFrag AFrag B
Step2-Frag1ShS15_F1ShS15_R2Step1-Frag1Step1-Frag2
Step2-Frag2ShS15_F3ShS15_R4Step1-Frag3X (D.W. added)
PCR: 98℃ (2min) - \[98℃ (25s) - 59℃ (25s) - 72℃ (30s)] x 30 cycles - 72℃ (3min) - 16℃ ### PCR step 3 | Reagent | Volumn | | ----------------------- | ------------------- | | Q5 polymerase | 0.5uL | | Q5 reaction buffer (5X) | 10uL | | ShS15\_F1 (10pmol) | 2.5uL | | ShS15\_R4 (10pmol) | 2.5uL | | Step2-Frag1 | 3uL | | Step2-Frag2 | 3uL | | dNTP | 1uL | | D.W. | 27.5uL (up to 50uL) | PCR: 98℃ (2min) - \[98℃ (25s) - 59℃ (25s) - 72℃ (30s)] x 25 cycles - 72℃ (3min) - 16℃ 최종 product (step3 PCR)를 2% agarose gel에 내려봤을 때, 예상하는 사이즈에서 밴드가 나오는 것을 볼 수 있다. 이를 [gel purification](https://gsyu.gitbook.io/protocol/biology/basic-experiments/basic-methods/gel-purification)한 후, cloning 등 원하는 목적에 사용한다. {% hint style="warning" %} PCR을 통해 얻은 것이므로, 반드시 sequencing해서 mutation 여부를 확인해야 한다. {% endhint %}

Overlap extension PCR product를 gel에 내려서 찍은 결과 사진. Step2 Frag 1/2는 총 30 cycles을 돌린 후 step 3에 일부 넣은 후 추가로 30 cycles PCR을 돌린 것을 내린 것이다 (총 60 cycles).

{% hint style="info" %} 위 예시에서는 밴드가 강하게 나왔으므로, 양이 충분하다면 PCR cycle 수를 낮춰도 좋다. {% endhint %}