Mammalian cell

Cell Seeding

실험에 필요한 정확한 세포 수를 계산하여 적합한 well dish에 세포를 분배하여 세포 배양한다.

준비물

Complete media:

PBS:

Trypsin-EDTA (T/E)

실험 과정

1. Complete media, PBS, T/E를 꺼내서 37℃ water bath에 10~15분 넣어서 미리 데워 둔다.

2. Suction으로 cell dish의 media를 제거한다.

3. PBS로 wash 후, suction으로 제거 ⇒ 죽은 세포, 이물질, 남은 media

4. Trypsin EDTA를 넣고 부드럽게 퍼뜨리고, Incubator 1~2분 ⇒ adhesion 단백질을 떼어내 줌

5. 15ml 튜브(tube)에 9ml media + 1ml cell containing trypsin EDTA solution을 최대한 모아 넣는다

6. 원심 분리(Centrifuge) = 1000 rpm으로 3분 돌려서 cell pellet을 만든다.

7. 상층액을 제거하고, tube에 5ml media 첨가해서 세포를 풀어준다.

8. Cell counting ⇒ 10 μl cell media + 10 μl 0.4% trypan blue stain(염색약)

9. 각 well마다 3ml media 첨가 ⇒ 6well 기준, 각 well마다 = media 3ml (고정값) + counting cell (μl). cell counting 계산 결과에 맞는 양을 피펫(pipette)으로 따서 dish에 넣는다.

10. 세포가 dish에 적절하게 있는지 현미경으로 관찰

11. Incubator에 넣고 배양한다.

Cell line마다 바닥에서 떨어뜨리기 위해 처리해야 하는 trypsin EDTA 양이 다르다. 예를 들어, HEK293T cell line은 잘 떨어지는 편이며, 100-mm dish 기준, Trypsin EDTA 500uL이면 충분하다.